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關于吞噬細胞的磷脂酰絲氨酸外翻的關系的論文
引言
作為天然免疫的重要組成部分, 血清調理素(serum opsonin)-包括補體和抗體-能夠有效地促進吞噬細胞的吞噬作用, 此即調理作用(opsonization). 有研究表明, 一些吞噬細胞只有在血清存在的情況下, 才能發揮吞噬作用, 這種現象稱之為血清依賴的調理作用.一般來說, 調理作用的目的是清除一些被調理(opsonized)的顆粒性抗原, 這一過程通常是由吞噬細胞膜表面的特異性受體介導的, 如FcR、CR1等. 目前發現血清中能夠發揮調理作用的分子還有很多, 如血小板反應蛋白Ⅰ、β2糖蛋白Ⅰ、C反應蛋白、DNA酶Ⅰ等等, 而這些分子是否借助特定的膜受體發揮調理作用、通過哪些受體發揮作用、是否還有其他影響調理作用的機制等很多問題目前還不清楚, 因此有必要對血清依賴的調理作用的機制進行進一步的研究.磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)是細胞膜的一種成分, 通常位于細胞膜的內層, 在細胞發生凋亡的時候, 細胞膜的這種不對稱性發生了破壞, 導致PS的外翻(inside-to-outsidemovement or flop). 然而, PS外翻并不總是意味著細胞的凋亡, 如單核細胞來源的吞噬細胞表面就組成型的表達PS, 并且有研究表明這種PS外翻與其特定的吞噬功能密切相關. 如果封閉其表面的PS, 單核吞噬細胞吞噬凋亡胸腺細胞的活性顯著下降, 但是對其他受體介導的吞噬活性并無抑制作用, 因此表面外翻的PS是單核吞噬細胞特定清除凋亡細胞所必需的. 然而, 目前對于單核吞噬細胞表面PS外翻的機制有不同的看法, 有人認為由凋亡細胞上脫落下來的囊泡被吞噬細胞攝取后將外翻的PS傳遞給了后者. 還有人認為是PS轉運蛋白將PS從胞膜內側轉運到了外側, 或者是膜的不對稱性在單核吞噬細胞中與其他細胞有所不同. 因此導致單核細胞表面PS外翻的機制仍然是不清楚的.眾所周知, 細胞所處的微環境對于細胞發揮生理功能具有重要的影響, 單核吞噬細胞在體內通常處于血清所組成的微環境中, 因此我們考慮吞噬細胞的PS外翻與血清依賴的調理作用之間是否存在某種聯系呢? 在本文中我們對這一問題進行了研究.在本研究中, 我們通過Annexin V染色來示蹤PS. 結果顯示外周血單核細胞(peripheralblood mononuclear cells, PBMC)在體外剛分離出來時, PS外翻的細胞比例很低, 但是在經過一段時間培養后再進行檢測時, 這群細胞的比例顯著升高, 這種PS外翻的現象在接觸血清后的很短時間內(1 h內)就能檢測到. 通過流式表型分析, 這群細胞大多是MHC-Ⅱ+的, 證明其確是PBMC中的單核吞噬細胞. 我們對細胞的吞噬能力進行了檢測, 結果表明在血清誘導的PS外翻的前提下, 加入能與PS特異性結合的Annexin V, 能夠顯著地增加細胞吞噬細菌的能力, 因此我們的研究表明, 血清能夠誘導PBMC的胞膜PS外翻, 并且外翻的PS參與了對細菌的調理作用.
1 材料和方法
1.1 材料
人外周血來自于實驗室志愿者, 經肝素鈉抗凝管采集. 表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌(Escherichia coli , E. coli )由華南理工大學藍東明副教授惠贈. Annexin V-FITC ApoptosisDetection Kit Ⅰ購自美國BD公司; 細胞脂質丙二醛(malondialdehyde, MDA)活性TBARS光度法定量檢測試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司; anti-CD3, anti-CD56和anti-HLADR單克隆抗體購自美國Beckman Coulter公司;Ficoll-paque分離液購自美國GE公司; RPMI1640培養基和胎牛血清均購自美國Life公司.
1.2 方法
1.2.1 PBMC的分離:
健康人外周血經抗凝管采集后, 用等量的生理鹽水進行稀釋, 稀釋后的外周血小心鋪加于含適量Ficoll-paque淋巴細胞分離液的液面上, 隨后按要求進行離心、吸取和洗滌, 洗滌后的PBMC或進行流式檢測或重懸于相應的培養基中進行后續實驗.
1.2.2 PBMC的體外處理:
長時間培養: 新鮮分離的PBMC或者立即上機檢測, 或者重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中, 同時加入終濃度為1000 IU/mL的IL-2, 以及100 IU/mL的氨芐青霉素和50 μg/mL的鏈霉素, 每3 d進行半量換液, 在培養的3 d和7 d分別進行相應的檢測.短期處理: 新鮮分離的PBMC重懸于含有或者不含胎牛血清的RPMI 1640培養基中, 于37 ℃ 50 mL/L CO2條件下培養1 h, 然后收集細胞進行相應的檢測.
1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙標記檢測:
取1×106個細胞, 收集于1.5 mL離心管中, 400 g 離心8 min, 棄上清液, 用預冷的PBS洗滌2次, 重懸于100 μL binding buffer中. 避光加入2.5 μLAnnexin V-FITC和5 μL PI于細胞懸液中, 輕輕混勻. 常溫避光染色15 min. 再加入400 μLbinding buffer混懸細胞, 轉移至流式管, 1 h內進行流式分析.
1.2.4 TBARS光度法脂質過氧化檢測:
取2×107個細胞, 參照Genmed公司脂質過氧化檢測試劑盒的檢測方法, 提取總蛋白, BCA法測定總蛋白濃度, 并調節蛋白濃度一致(在20-50 mg/mL范圍內), 酶標儀檢測MDA的吸光值.
1.2.5 流式抗體與Annexin V-FITC共染:
取1×106個細胞, PBS洗滌、重懸后加入相應熒光標記的單克隆抗體, 避光染色20 min后用預冷的PBS洗滌2次, 重懸于100 μL binding buffer中,按上述方法加入Annexin V-FITC進行染色, 1 h內進行流式分析.1.2.6 PBMC的吞噬效率檢測: 利用4%甲醛對綠色熒光蛋白細菌進行固定, 經PBS洗滌后, 取100 μL菌液加入各組PBMC細胞, 于37 ℃ 50mL/L CO2條件下培養30 min后, 利用流式細胞儀檢測細胞的吞噬效率, 將FS閾值設為100, 以去除游離細菌的干擾.
1.3統計學處理
本實驗相關數據利用Excel進行統計分析, 相關數據以mean±SD表示, 采用單因素方差分析比較各組差異. 當P<0.05為差異具有統計學意義.
2 結果
2.1 PBMC體外培養前后PS+細胞比例的變化
利用Ficoll-paque從外周血中分離PBMC, 經生理鹽水洗滌后, 一部分進行Annexin V/PI染色, 并進行流式檢測. 其余部分重懸于含10%FBS的RPMI 1640培養基中, 于37 ℃, 50mL/L CO2條件下培養, 分別在培養的3 d和7 d收集細胞, 利用流式檢測Annexin V/PI的染色情況. 結果顯示, 培養后的PBMC其Annexin V染色陽性比例有顯著的增加, 剛分離時PBMC中Annexin V+細胞比例為2%左右,在培養至第3天時, 這一比例超過了6%, 第7天時仍略有上升. 但是增加的Annexin V單陽性的這部分細胞并沒有隨著時間的增加而進入Annexin V/PI雙陽性象限, 第7天和第3天時Annexin V+/PI+差異沒有統計學意義(P<0.05), 從而證明Annexin V單陽性的這部分細胞并不是處于早期凋亡狀態的細胞, 而只是發生了PS外翻.
2.2 經過短暫的血清處理后PS+細胞的變化
取新鮮分離的PBMC樣本, 經生理鹽水洗滌后, 分別用含有或者不含胎牛血清的RPMI 1640培養基重懸, 于37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養1 h后, 收集細胞進行Annexin V-FITC/PI雙標記流式檢測. 結果顯示, 含血清培養基處理的PBMC其Annexin V+細胞比例顯著高于不含血清培養基處理組, 且具有顯著性差異(P<0.05), 而PI染色陽性細胞在處理前后并沒有顯著差異.這表明血清處理能夠顯著促使PBMC胞膜的PS外翻.
2.3 不同培養條件下MDA的含量檢測
有研究指出, Annexin V除了能與PS結合外, 還能夠與細胞膜中的一些脂質過氧化產物, 如MDA結合]. 因此為了排除Annexin V染色是由于PBMC胞膜中的MDA增加造成的, 我們對各組PBMC中的MDA含量進行了檢測, 以H2O2處理組作為陽性對照. 結果表明, 含血清培養基處理的PBMC胞膜MDA含量與不含血清培養基處理的PBMC組沒有顯著差異, 但是兩者均與H2O2處理組差異具有統計學意義(P<0.05), 這表明PBMC中Annexin V染色陽性確實是由于PS外翻造成的.
2.4 PBMC中PS+細胞的表型
由于PBMC中含有不同類型的細胞, 我們又對不同類型細胞表面PS外翻的情況進行了檢測. 結果顯示, 在檢測的幾種PBMC細胞中, 血清處理后annexin V+細胞中只有HLA-DR+細胞的PS外翻顯著增加, 其他幾種細胞的比例都是下降的, 且差異均具有統計學意義(P<0.05). 這表明PBMC中的單核吞噬細胞是對血清處理敏感的主要細胞亞群, 血清接觸是促使其PS外翻的重要條件.
2.5 PS外翻對細胞吞噬細菌能力的影響
為了闡明外翻的PS是否能夠影響細胞的吞噬作用,我們對血清處理前后PBMC吞噬綠色熒光蛋白細菌的能力進行了檢測. 結果表明, 未經血清處理的PBMC其吞噬能力非常低, 只有1%左右的細胞具有吞噬能力; 經過血清處理后,吞噬細胞的比例超過了9%; 而利用PS特異性的配體Annexin V與血清一起處理PBMC, 則吞噬細胞的比例增加到了12%左右, 并且未經血清處理組與其他兩組間差異具有統計學意義(P<0.01), 其他兩組之間差異也具有統計學意義(P <0.05). 這一結果表明, 外翻的PS參與了吞噬細胞對細菌的吞噬作用.
3 討論
大部分的細胞其氨基磷脂都是分布在細胞膜的內側, 這是一個耗能的過程, 表明這種分布對于正常的細胞功能至關重要. 然而部分類型的細胞如巨噬細胞、血小板、B淋巴細胞、成肌細胞等, 在正常生理狀態下, 其PS組成型的位于胞膜外側, 表明暴露的PS對于這些細胞的功能和分化非常重要.
有研究表明, PS外翻對于吞噬細胞發揮吞噬凋亡細胞的功能具有促進作用, 但是對于Fc受體介導的對紅細胞的吞噬作用沒有影響. 然而如前所述, 對于吞噬細胞PS外翻的機制, 目前還沒有統一的看法. 而吞噬細胞血清依賴的調理作用這一現象, 使得我們認識到有必要對血清處理和PS外翻之間的聯系進行研究.
我們的結果顯示, 體外新鮮分離的PBMC在接觸血清之前, 其PS+細胞比例很低, 一旦接觸血清, PS+細胞的比例很快有顯著性的升高. 結合細胞表型分析, 升高的PS+細胞主要是HLA-DR+的, 表明血清接觸主要促進PBMC中單核吞噬細胞的PS外翻. 短暫的接觸就能誘導顯著的PS外翻, 并且發生在沒有外來凋亡細胞存在的情況下, 這一結果排除了吞噬細胞攝取凋亡細胞脫落的囊泡從而導致其PS顯露在胞外的可能性. 同時由于這種PS外翻發生的時間較短(可以發生在1 h甚至更短的時間內), 不太可能依賴于某些基因表達的變化, 因此這也表明, 是血清中的某種特定成分直接誘導或者通過細胞膜上的PS轉運蛋白導致單核吞噬細胞發生了PS的外翻. 此外, 針對細菌的吞噬能力檢測顯示, 血清誘導的PS外翻參與了吞噬細胞對細菌的調理作用, 這表明血清調理作用, 不僅可以通過FcR和補體受體等分子發揮作用, 也可以通過PS發揮作用.
至于血清中的何種成分誘導了單核吞噬細胞的PS外翻, 血清誘導的PS外翻是否需要細胞膜中PS轉運蛋白的參與以及何種轉運蛋白的參與, 這種表型變化對其功能有何意義, 這些問題都有待進一步的深入研究.
總之, 本研究表明吞噬細胞PS外翻是血清依賴的, 并且這種外翻的PS參與了對細菌的調理作用, 這一結果為揭示吞噬細胞PS外翻的機制提供了思路.
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