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蛋白提取實驗步驟
在學(xué)習(xí)、工作生活中,報告不再是罕見的東西,通常情況下,報告的內(nèi)容含量大、篇幅較長。為了讓您不再為寫報告頭疼,下面是小編幫大家整理的蛋白提取實驗步驟,歡迎大家分享。
蛋白提取實驗步驟:
1、細(xì)胞總蛋白提取
A、對于懸浮細(xì)胞: 離心收集細(xì)胞,每106細(xì)胞加250 ul RIPA(在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑),振蕩。如果需要提高蛋白濃度,可以適當(dāng)減少細(xì)胞總蛋白提取試劑體積。
B、對于貼壁細(xì)胞:
a、用TBS沖洗細(xì)胞2-3次。最后一次徹底吸干殘留液。
b、加入適當(dāng)體積的 RIPA(使用前數(shù)分內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)于培養(yǎng)板、瓶內(nèi)3-5分鐘。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板、瓶,使試劑與細(xì)胞充分接觸。
c、用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下,收集到1.5ml離心管中。
C、冰浴30min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保細(xì)胞完全裂解。
D、12000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。
2、組織蛋白提取:
A、組織塊用冷TBS洗滌2-3次,去除血污,剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)冰上徹底勻漿。如果需要提高蛋白濃度,可以適量減少該試劑體積。
B、將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中,振蕩。冰浴30min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保細(xì)胞完全裂解。
C、12000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。
注意事項
1、組織盡可能新鮮,若不能及時提蛋白,組織標(biāo)本應(yīng)保存在-80℃冰箱,并避免反復(fù)凍融。
2、全程必須在冰上進(jìn)行,避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制劑在水溶液中不穩(wěn)定,需在RIPA使用前數(shù)分鐘加入蛋白酶抑制劑。
4、裂解過程中如有溶液粘稠現(xiàn)象可用移液器(200μl)反復(fù)吹打,或再加入適量裂解液以保證充分裂解。
5、總蛋白溶液不穩(wěn)定(蛋白酶依舊有活性)可在-80℃短時間保存,建議立即加入蛋白上樣緩沖液變性后與-20℃保存,避免反復(fù)凍融。
蛋白質(zhì)的分類,從來源上可以分為動物蛋白質(zhì)、植物蛋白質(zhì);從營養(yǎng)學(xué)上可以分為完全蛋白質(zhì)、半完全蛋白質(zhì)、不完全蛋白質(zhì)。
1.來源分類
(1)動物性蛋白質(zhì):主要包括一些動物的肉類(比如牛肉、豬肉、魚肉、雞肉等)以及蛋類(雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋等)、奶產(chǎn)品(牛奶、羊奶等)等,含有較多的氨基酸,有豐富的營養(yǎng)成分,易吸收。
(2)植物性蛋白質(zhì):主要來源于豆制品(豆腐、豆皮、豆?jié){等)或者是谷類(大米、小麥、小米等)等食品,含有不同含量的植物蛋白質(zhì)。
2.營養(yǎng)學(xué)分類
(1)完全蛋白質(zhì)中所含氨基酸相比較來說品種比較多,數(shù)量也充足,比如:奶制品、蛋類、動物肝臟等食物中的蛋白質(zhì)。
(2)不完全蛋白質(zhì)含有氨基酸種類和數(shù)量都比較少,例如動物明膠、玉米膠蛋白。
(3)半完全蛋白質(zhì)氨基酸種類也比較多,但相比較來說含量不足,比如麥膠蛋白中的成份。
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