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mRNA差異顯示方法研究進(jìn)展
[關(guān)鍵詞] DD-PCR 骨科學(xué) 研究健康網(wǎng)訊:
黨耕町 100083 北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨科
宋國立 美國加州大學(xué)圣地亞哥分校骨科與生物工程系
哺乳動(dòng)物細(xì)胞約有100?000個(gè)不同的基因，在一定時(shí)間、空間中僅有10％～15％的基因表達(dá)，這種表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控［1］。運(yùn)用mRNA 差異顯示（differential display,DD）方法［2］，可將不同細(xì)胞類型或同一細(xì)胞在不同環(huán)境下表達(dá)的基因進(jìn)行比較，從分子生物學(xué)水平上提供信息，這對理解細(xì)胞的生命過程極有幫助。該技術(shù)一經(jīng)問世，立即得到廣泛應(yīng)用，但同時(shí)也遇到許多問題，所以Debouck［3］曾對該方法提出質(zhì)疑�，F(xiàn)將DD的研究進(jìn)展簡要綜述如下。
一、DD方法基本原理
DD的基本原理是將具有可比性的細(xì)胞在某一條件下可表達(dá)的mRNA 群體通過逆轉(zhuǎn)錄方法變成相應(yīng)的cDNA 群體，以此為模板，利用一對特殊引物，即3?anchor 引物和5?arbitrary引物，在一定條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與mRNA相對應(yīng)的“標(biāo)簽”（tags），然后用變性聚丙烯酰胺測序膠分析其差別，將有差別的基因克隆化，進(jìn)一步分析其結(jié)構(gòu)與功能。DD依賴三種技術(shù)：（1）mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)；（2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)；（3）DNA測序膠電泳技術(shù)。
二、DD方法的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用
用某一方法來尋找mRNA表達(dá)的差異，至少要滿足下列要求：（1）在一定時(shí)間、空間里，每一個(gè)細(xì)胞約有15 000種mRNA表達(dá)，其中除少數(shù)屬高豐度表達(dá)外，大量的屬于低豐度表達(dá)，即要求使用的方法足以顯示低豐度mRNA；（2）重復(fù)性要好；（3）實(shí)驗(yàn)過程中能夠步步驗(yàn)證比較（side-by-side comparison）；（4）得到的產(chǎn)物能代表相應(yīng)的mRNAs或cDNAs，并能由此找到相應(yīng)的cDNA 序列；（5）省時(shí)，簡便易行。
既往對mRNA的比較研究中多用減數(shù)雜交方法［4］（subtraction hybridization），該方法靈敏，可顯示低豐度RNA，但是步驟復(fù)雜，需時(shí)較長，而且在得到最終結(jié)果前無法步步驗(yàn)證對照比較，故不易重復(fù)，并且需要大量的RNA作起始研究材料。這一點(diǎn)對RNA來源不易者（如手術(shù)活檢標(biāo)本）極不利［5，6］。
DD的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）僅需0.2 μg總RNA作為起始材料；（2）可同時(shí)分析多組樣品；（3）敏感性高，可檢出低豐度mRNA；（4）實(shí)驗(yàn)周期短，約8天即可完成［7］，便于重復(fù)；（5）最突出的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)過程中可步步驗(yàn)證比較。可簡單地將DD的特點(diǎn)概括為“3SRV”，即“Simplicity，Sensitivity，Speed，Reproducibility，Versatility”。
DD方法因有上述優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用。例如：Musholt等［8］應(yīng)用DD方法對手術(shù)切下的髓樣甲狀腺癌標(biāo)本與局部轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的表達(dá)基因MDF-1和MDF-2，并認(rèn)為這兩個(gè)基因在髓樣甲狀腺癌的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移中起了重要作用；Zuo等［9］研究潰瘍
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