微生物實驗工作總結
一、培養基
（一）培養基的營養成分
一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽，有些微生物需要添加特殊營養物質（如培養乳酸桿菌時需添加生長因子：維生素）
高考警示鐘：自養微生物與異養微生物所需的營養物質不同
(1)自養微生物所需的碳源來自含碳的無機物（如CO2），而異養微生物需要的碳源來自含碳的有機物，因此可根據培養基中營養物質判斷微生物的代謝類型。
(2)含氮無機物不但能給自養微生物提供氮源，也能作為能源物質，提供能量，如NH3既作為硝化細菌的氮源也作為能源。
（二）培養基的配制原則
(1)目的明確。要根據微生物的種類、培養目的等選擇原料、配制培養基。
(2)營養要協調。各種營養物質要保證適當的濃度和比例。營養物質比例過低，不能滿足微生物生長；濃度過高則會抑制微生物的正常生長。
(3)pH要適當。不同微生物生長所需pH不同。如細菌為中性或微堿性（6.5～7.5）；霉菌等真菌為酸性（5.0～6.0）。
（三）培養基的分類及作用：
1.物理性質：根據是否添加瓊脂等凝固劑
（1）液體培養基：不加凝固劑，常用于工業生產
（2）固體培養基：加凝固劑，常用于微生物分離、鑒定、活菌計數
2.用途或功能
（1）選擇培養基：培養基中加入或去除某種化學物質，允許特定種類的微生物生長,同時抑制或阻止其他種類微生物生長。
常見例子：
①培養基中加入青霉素，篩選酵母茵或霉菌等真菌；
②培養基中加入高濃度食鹽，篩選金黃色葡萄球菌；
③無氮培養基，篩選固氮微生物；
④無碳培養基，篩選自養微生物；
⑤以石油為唯一碳源，選擇能分解石油的微生物；
⑥以尿素為唯一氮源，篩選尿素分解菌；
⑦以纖維素為唯一碳源，通過是否產生透明圈篩選纖維素分解菌。
⑧將培養基放在高溫環境中培養，分離耐高溫的微生物。
（2）鑒別培養基：根據微生物的代謝特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品,以鑒別不種類的微生物。
①伊紅一美藍培養基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，茵落呈深紫色，并帶有金屬光澤)；
②培養基中加入酚紅指示劑，鑒定尿素分解菌；
③培養基中加入剛果紅（CR），鑒定纖維素分解菌。
注意：
①病毒為非細胞結構的生物體，專營活細胞寄生，目前不能利用人工培養基來培養，需接種在動植物組織中才能增殖。常用于培養病毒的是活雞胚。
②加入培養基中的凝固劑(如瓊脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。
二、無菌技術
（一）關鍵
獲得純凈培養物的關鍵是防止外來雜菌入侵。
（二）消毒、滅菌:
二者主要區別中：芽孢和孢子是否存活（芽孢是微生物度過不良環境的體眠體，而孢子是微生物進行無性生殖時的繁殖體即無性生殖細胞。）
1.消毒:使用較為溫和的物理或化學方法，僅殺死物體表面或內部一部分對人體等有害的微生物(不包括孢子和芽孢)
常用方法
應用范圍
巴氏消毒法：70～75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min
一些不耐高溫的物體如牛奶
煮沸消毒法：在100℃水浴中煮沸5～6 min
一般物品
化學藥劑消毒法：用乙醇、氯氣、KMnO4等藥劑來殺死或抑制細菌生長或繁殖
可用來對環境、雙手和衣物等消毒
紫外線消毒法：30W紫外燈照射30min
接種室、接種箱、超凈工作臺
2.滅菌:使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子
常用方法
應用范圍
灼燒滅菌法：酒精燈火焰
接種工具如接種環、接種針等
干熱滅菌法：在160～170℃加熱1～2h
如玻璃器皿(吸管、培養皿)和金屬用具
高壓蒸汽滅菌：壓力為100 kPa，溫度為12l℃的條件下，維持15～30 min
培養基及容器的滅菌
注意：
（1）酒精消毒用體積分數為70%的酒精效果最好，濃度過低。殺菌力弱，濃度過高，會使菌體表面蛋白凝固成一層保護膜，乙醇分子不能進入其中
（2）關于高壓蒸汽滅菌注意以下幾點：
①壓力為100 kPa，溫度為12l℃的條件下，維持15～30 min；
②注意同時旋緊相對的兩個螺旋，使螺栓松緊一致；
③到滅菌時間后，當壓力表的壓力降為零時，才能打開排氣閥，否則滅菌鍋的液體會沖出容器，造成污染。
（3）滅菌消毒的原理，就是通過一定理化手段，使病原茵蛋白質變性，失去生命活性。
（4）灼燒滅菌用的是酒精燈火焰的充分燃燒層。
三、微生物的純化培養技術
（一）常用細菌培養基——牛肉膏蛋白胨培養基配制流程：
計算
稱量
溶化
滅菌
注意：據配方計算配制一定體積培養基時各成分的用量
注意：
①倒平板時，燒杯口要通過酒精燈火焰滅菌。
②平板冷凝后要將平板倒置，既可防止皿蓋上凝結的水滴滴入培養基造成污染；又可使培養基表面的水分更好的揮發。
（調PH）
倒平板
注意：
①牛肉膏較粘稠，應玻棒挑取，在稱量紙上稱量
②牛肉膏蛋白胨易吸潮，動作要迅速
注意：
①溶化瓊脂時要不斷攪拌，防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂；
②加熱過程中部分水分蒸發，待瓊脂完全溶化后應補加蒸餾水，以保持溶液的濃度
注意：
由于不同微生物適宜的pH不同，因此在熔化后，必須用NaOH或HCl來調節pH
注意：
①用高壓蒸汽滅菌法
②培養基先調PH再滅菌
③一般是培養基先滅菌再倒平板
計算
稱量
溶化
滅菌
注意：據配方計算配制一定體積培養基時各成分的用量
注意：
①倒平板時，燒杯口要通過酒精燈火焰滅菌。
②平板冷凝后要將平板倒置，既可防止皿蓋上凝結的水滴滴入培養基造成污染；又可使培養基表面的水分更好的'揮發。
（調PH）
倒平板
注意：
①牛肉膏較粘稠，應玻棒挑取，在稱量紙上稱量
②牛肉膏蛋白胨易吸潮，動作要迅速
注意：
①溶化瓊脂時要不斷攪拌，防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂；
②加熱過程中部分水分蒸發，待瓊脂完全溶化后應補加蒸餾水，以保持溶液的濃度
注意：
由于不同微生物適宜的pH不同，因此在熔化后，必須用NaOH或HCl來調節pH
注意：
①用高壓蒸汽滅菌法
②培養基先調PH再滅菌
③一般是培養基先滅菌再倒平板
（二）純化大腸桿菌
1．原理：在培養基上將細菌稀釋或分散成單個細胞，使其長成單個的菌落，這個菌落就是純化的細菌菌落。
2．微生物接種方法：
平板劃線法（只可純化）和稀釋涂布平板法（既可純化又可計數）
(1)平板劃線法：固體培養上→連續劃線→逐步稀釋→單個細胞繁殖而成的菌落 (如圖)
注意：
a.用接種環取菌種之前、每次劃線之前和劃線結束都要進行灼燒滅菌，灼燒后要在酒精燈附近冷卻后再操作；
燒灼時期
目的
取菌種前
殺死接種環上原有微生物
每次劃線前
殺死上次劃線后接種環上殘留菌種，使下次劃線的菌種直接來自于上次劃線末端，使每次劃線菌種數目減少，達到分離菌株的目的
接種結束后
殺死接種環上殘存的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者
b.劃線時不要劃破培養基，如果采用分段劃線法操作從第二次操作應總在上一次劃線末端開始，首尾區不能相連；
c.操作必須始終在酒精燈火焰旁進行。
(2)稀釋涂布平板法：10倍系列稀釋操作(一系列梯度稀釋) →稀釋度足夠高的菌液→分散成單個細胞→單個菌落
稀釋涂布平板的操作比較復雜，且各個細節均需保證“無菌”，應特別注意：
a.配制系列梯度稀釋液時，必須用無菌水配制；
b.涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在燒杯中滴盡，沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰引燃。不要將過熱的涂布器放入盛有酒精的燒杯中，一面引燃其中的酒精；
c. 吸管頭不要接觸任何其他物體；吸管要在酒精燈火焰周圍使用。
3．菌種的保存
保存時間
保存方法
具體方法
后續處理
頻繁
使用
臨時保藏法
將菌種接種到試管的固體斜面培養基上，培養，長成菌落后，放入4_℃的冰箱中保藏
每3～6個月需重新接種。否則菌種容易被污染或產生變異
長期
保存
甘油
管藏法
在3 mL甘油瓶中，裝入1 mL甘油后滅菌，將1 mL菌液轉移到甘油瓶中與甘油充分混合
放入－20_℃的冷凍箱中保存
將菌種放在低溫環境中保藏的目的是降低微生物的新陳代謝速率。
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