人regucalcin cDNA高表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在原核細(xì)胞中的表達(dá)

目的原核表達(dá)獲得大量人regucalcin(RGN)蛋白.方法用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)從人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)中擴(kuò)增RGN全長cDNA,將擴(kuò)增的產(chǎn)物連接于測序載體pMD18-T,測序鑒定準(zhǔn)確后,進(jìn)行酶切,將正確的RGN全長cDNA與原核表達(dá)載體pET42b(+)構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET42b(+)-RGN.將pET42b(+)-RGN先轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α,提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定正確后,再轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主大腸桿菌DE3菌株.對(duì)轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行誘導(dǎo)、破菌,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)與免疫印跡分析,鑒定RGN融合蛋白質(zhì)表達(dá)的正確性.RGN重組融合蛋白經(jīng)Ni2+親和層析純化,達(dá)電泳純.結(jié)果構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET42b(+)-RGN并獲得高效表達(dá),RGN重組融合蛋白經(jīng)異丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后以包涵體形式存在,表達(dá)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為34 000.結(jié)論人RGN蛋白在pET42b(+)原核表達(dá)載體可獲得高效表達(dá),為進(jìn)一步了解RGN蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及其抗體的制備等奠定了基礎(chǔ).

作 者： 徐洪 胡亮 倪培華 吳潔敏 趙涵芳 XU Hong HU Liang NI Peihua WU Jiemin ZHAO Hanfang   作者單位： 徐洪,胡亮,趙涵芳,XU Hong,HU Liang,ZHAO Hanfang(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,上海,200025)

倪培華,吳潔敏,NI Peihua,WU Jiemin(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系,上海,200025) 

刊 名： 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)  ISTIC PKU 英文刊名： LABORATORY MEDICINE  年，卷(期)： 2006 21(4)  分類號(hào)： Q503  關(guān)鍵詞： Regucalcin   克隆   原核表達(dá)  

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