非小細胞肺癌患者外周血DC亞型與 NK細胞的關系論文

　　【摘要】 目的 探討非小細胞肺癌患者外周血樹突狀細胞亞群（dc1/dc2）和機體nk細胞含量之間的關系及其臨床意義。方法 采用流式細胞術檢測40例肺癌患者外周血dc亞群（cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc／dc2）、nk細胞含量及血漿il12的濃度， 并以10例健康受試者作為對照。結果 肺癌患者外周血cd11c+dc百分率為（0.66±0.24）％，比對照組（1.38±0.18）％明顯降低（p<0.01），cd123+ dc百分率（0.28±0.17）％與對照組（0.27±0.11）％相比， 差異無統計學意義（p＞0.05）；肺癌患者與健康人比較，nk細胞含量及il12的濃度均降低（p<0.05）。nsclc 患者nk細胞的含量與cd11c+百分數及血漿il12 濃度均呈正相關（p<0.05），與cd123+百分數呈負相關（p<0.01）。dc各亞型百分率同患者的卡氏評分、化療史有關聯（p<0.01），nk細胞的含量與年齡相關（p<0.05）。結論 非小細胞肺癌患者dc1功能低下，il12分泌能力障礙，從而影響了nk細胞的活性。dc亞型與nk細胞含量之間以及它們與臨床生物學行為之間都有一定關系。

　　【關鍵詞】 肺癌 樹突狀細胞亞群 自然殺傷細胞

　　樹突狀細胞（dendritic cell，dc）是一種專職的抗原提呈細胞， 依據 dc起源和功能，將人外周血 dc 分為兩個亞群[14]。www.133229.CoM自然殺傷（nature killer，nk）細胞在機體免疫中地位重要，外周血nk細胞的變化是反映機體細胞免疫狀態的重要指標[5]。晚期非小細胞肺癌患者dc亞群的表達水平如何，它同患者機體nk細胞的關系如何，以及此二者同步檢測的臨床意義究竟如何，目前尚無定論。本研究對40例晚期非小細胞肺癌患者的dc亞群和機體免疫狀態進行了同步檢測和分析，現總結報告如下。

　　1 資料與方法

　　1.1 病例選擇

　　收集符合納入標準的非小細胞肺癌患者40例，對照組10例，均為健康受試者。

　　1.1.1 納入標準 （1）有明確病理診斷的iii～iv期非小細胞肺癌患者；（2）心、肝、腎和造血系統功能基本正常；（3）預計生存期在6個月以上；（4）karnofsky評分≥60分。

　　1.1.2 排除標準 （1）無明確病理診斷者；（2）預期生存期<6個月者；（3）合并有心、肝、腎和造血系統等嚴重疾病；（4）兒童、孕婦和精神病患者。

　　1.2 一般資料

　　按照上述條件共納入40名患者，均為我科2006年8月～2006年12月期間的住院病人。其中男27例，女13例；年齡38～82歲，中位年齡63歲； iii期15例，iv期25例；病理類型：腺癌23例，鱗癌17例。

　　1.3 試劑與儀器

　　免疫熒光三標記 dc 檢測試劑盒（3瞔olor dendritic value bundle）購自美國 becton dickson 公司，內有fitc標記的 lineage cocktail 1 （lin1），由cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56系列抗原混合單抗組成， cd11c瞤e、cd123（抗il3r）pe，抗hla瞕r瞤ercp及 陰 性 同 型 對照小鼠igg1瞤e/igg2瞤e；fitc或pe標記鼠抗人cd3-并cd16/cd56+單克隆抗體，facs calibur流式細胞儀（美國 becton dickson公司生產），離心機等。

　　1.4 測定指標與方法

　　1.4.1 外周血 dc1/dc2 亞型的檢測 參考文獻[6]，取肝素抗凝外周血500μl，分裝4管， 每管100μl全血， 加入lin1、抗hla瞕r瞤ercp、cd123（抗il3r）pe、cd11c瞤e及陰性對照igg1瞤e/igg2瞤e單抗，振蕩混勻，室溫暗處反應15min，加入2ml溶血素，混勻、裂解10min，離心棄上清，洗滌1次，加入300μl的１％多聚甲醛溶液，用facs calibur流式細胞儀每管收集50000個細胞，fsc設閾值，排除碎片干擾，用cell quest 軟件獲取及分析hla瞕r／lin1點圖中的hla瞕r陽性、lin 1弱陽性和陰性的細胞群體，以cd11c和cd123熒光抗體染色陽性細胞百分率記錄結果。

　　1.4.2 nk細胞的檢測 參考文獻[7]，用fitc或pe標記鼠抗人cd3-并cd16/cd56+單克隆抗體，由流式細胞儀測定外周血中nk細胞含量。

　　1.4.3 血漿il12濃度檢測 按照il12試劑盒的.操作說明進行： 于96孔酶標板中每孔加入assay diluent rdif 50μl，各孔中分別加入已配制的il12標準液或已經室溫融化并離心的血漿樣本200μl，室溫靜置2h，棄上清液并用washer buffer洗滌3次，各孔中加入200μl il12結合物，室溫靜置2h，棄上清液并用washer buffer洗滌3次，加入200μ1底物溶液，室溫避光靜置20min，加入50μl終止液，靜置25min后上酶標儀(450nm)讀取od值，繪制標準曲線并求出各標本的血漿il12濃度。

　　1.5 統計學方法

　　應用spss13.0統計分析軟件對實驗數據進行統計，采用兩樣本均數差別的秩和檢驗、雙變量相關分析及偏相關分析。

　　2 結果

　　2.1 外周血中樹突狀細胞亞型的檢測

　　肺癌患者外周血髓系樹突狀細胞（mdc，cd11c+）的表達與正常對照組比較顯著降低（p<0.01），淋巴系樹突狀細胞(ldc，cd123+)的表達與正常對照組比較差異無統計學意義（p>0.05），見圖1、表1。表1 肺癌患者與健康對照組外周血樹突狀細胞亞型的檢測結果

　　2.2 外周血中nk細胞活性及血漿il12濃度的檢測

　　檢測結果顯示，nsclc 患者血漿il12 濃度為（3.19±0.30）pg/ml， 顯著低于正常人（8.21±1.80）pg/ml (p=0.000)。nsclc患者與健康人比較，nk細胞的殺傷能力減弱，其含量為（15.51±2.15）％，低于健康對照組的（22.53±15.25）％（p=0.018），見圖2、表2。

　　2.3 nsclc患者樹突狀細胞亞型、il12及nk細胞的含量之間相關性分析

　　對nsclc患者外周血中cd11c+、cd123+百

　　在fsc vs ssc散點圖中劃出單個核細胞區r1，然后將lin1表達陰性細胞設為r2（排除t、b、nk等細胞），再將hla-dr+cd11c+或hla-dr+cd123+設為r3（mdc或pdc）

　　圖1 dc亞型流式細胞圖

　　在fsc vs ssc散點圖中劃出淋巴細胞區r1，其中cd3-/cd16＋cd56+者即為nk細胞

　　圖2 nk細胞流式細胞圖

　　分數與il12、nk細胞的含量進行相關性分析，見表3。結果顯示，nsclc 患者血漿il12 濃度同cd11c+百分數呈正相關（p<0.05）；nk細胞的含量與cd11c+百分數呈正相關（p<0.05），而與cd123+百分數呈負相關（p<0.01）。而nsclc 患者血漿il12 濃度同nk細胞的含量之間亦有關聯性，即兩者呈正相關（p<0.01）。表2 肺癌患者與健康對照組外周血中 nk細胞含量及t細胞亞群的檢測結果表3 40例肺癌患者樹突狀細胞亞型與外周血il12、nk細胞含量之間的相關性表4 40例肺癌患者樹突狀細胞亞型與臨床病理特征的關系

　　2.4 肺癌患者樹突狀細胞亞型、nk細胞含量與臨床病理特征分析的關系

　　肺癌患者樹突狀細胞亞型、nk細胞含量與臨床病理特征的關系，見表4。按照卡氏評分（<80vs≥80）、化療史（有vs無）分組，cd11c+dc百分數有極其顯著性差異（p<0.01），cd123+dc百分數有顯著性差異（p<0.05）；按照病理類型（腺癌vs鱗癌）分組cd11c+dc百分數差異有統計學意義（p<0.05）；其余分組（性別、年齡、臨床分期）之間的各dc亞型百分數比較差異均無統計學意義。而nk細胞的含量僅與年齡相關（p<0.05），同其他臨床特征無明顯關聯（p>0.05）。

　　3 討論

　　3.1 肺癌患者dc亞型的特征

　　樹突狀細胞（dc）是一種專職的抗原提呈細胞， 依據 dc起源和功能，將人外周血 dc 分為兩個亞群：dc1亞群為髓樣細胞來源（myeloid dc），它以 cd11c+dc 前體形式存在于外周血中，在炎癥刺激時分化為成熟的 cd11c+ dc， 產生白細胞介素il12， 促進 th1 應答； dc2亞群為淋巴樣細胞來源（lymphoid dc）， 由其 cd123+dc 前體細胞加 il3 誘導后分化為成熟的淋巴樣 dc，不產生 il12，誘導 th2 應答。新鮮分離的外周血 dc 缺乏樹枝狀的形態學特征，其表面均弱表達或不表達單核細胞、淋巴細胞、嗜酸粒細胞、中性粒細胞及天然殺傷細胞的標記抗原， 但高表達hla瞕r 抗原。因此，將 淋 巴 細 胞 系 列 抗 原 （lin1：cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56的混合體） 表達陰性或弱陽性，hla瞕r表達陽性來初步界定dc群， 再根據 cd11c 和 cd123的表達來確定分別為 cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc/dc2。

　　本次的實驗結果表明：肺癌患者外周血cd11c+dc/dc1在白細胞中所占比例低于正常人（p=0.000），而cd123+ dc/dc2在白細胞中所占比例與正常人無顯著差異（p=0.829），且cd11c+dc/dc1在數量上比cd123+ dc/dc2占優勢，說明肺癌患者dc遞呈抗原水平低于正常人，提示肺癌患者機體免疫功能受損，難以促使未成熟dc向mdc分化，不能有效地通過細胞免疫途徑殺傷體內的肺癌細胞；而ldc無明顯增多，即th2型反應無明顯增強，說明體內針對肺癌細胞的體液免疫應答無明顯增強。

　　3.2 肺癌患者dc亞型與nk細胞的關系

　　樹突狀細胞（dc）和自然殺傷（nk）細胞是自身免疫系統的兩種獨特成分，在免疫調節和適應性免疫反應的建立過程中起關鍵性作用。nk細胞主要通過細胞毒性效應以及產生細胞因子起作用，而dc則識別病原體并向適應性免疫系統發出警報。nk細胞是自體免疫系統中主要的淋巴細胞，通過其細胞因子產物溶解細胞，在免疫監視、免疫防御中起著十分重要的作用，具有體外殺傷腫瘤細胞的功能。

　　研究表明，dc瞡k細胞相互作用可導致細胞激活、成熟甚至死亡。fernandez等[8]的早期研究通過證明dc激活nk細胞抗腫瘤活性，首先證實了體內dc瞡k細胞的相互作用。體外研究表明，nk細胞和成熟dc的接觸導致兩種細胞的激活和細胞因子的產生，包括nk細胞增殖和dc成熟[911]。dc可以通過各種機制提高nk細胞的生存率，增加nk細胞活性和分化。其中重要的機制之一就是dc分泌的細胞因子，如il12。il12曾一度被稱為自然殺傷細胞刺激因子或細胞毒性淋巴細胞分化因子，人體內的dc1可通過分泌il12，促進thl反應，誘導細胞免疫，而il12又可促進dc1的分化、成熟。事實上，人體內的dc能更好地支持nk細胞的存活[12]。成熟的dc還是il12的主要來源，il12可以增加nk細胞介導的細胞毒性和ifn撥貌生[13]。

　　本研究結果顯示nsclc患者外周血mdc含量及血漿il12降低，說明nsclc狀態下外周血mdc存在il12分泌能力的障礙，從而影響了nk細胞的活性。提示nsclc患者體內不僅存在mdc數量的減少，而且存在nk細胞功能上的缺陷。nsclc患者體內dc產生和功能上的缺陷是腫瘤細胞逃脫機體監視的重要機制之一。另外，檢測結果顯示，隨著cd123+ dc/dc2的百分含量下降，肺癌患者nk細胞含量增高（p=0.018），兩者呈顯著負相關。本試驗證實，dc瞡k之間的相互作用和通訊，構成了一個正反饋環路，一旦2種細胞中的任何一種細胞感受到了“危險”或組織損傷發生，這一環路將被激活。dc瞡k細胞之間的相互作用是接觸依賴型的，但也同時包括細胞因子之間的交互作用。

　　3.3 dc亞型與nk細胞之間關系分析的臨床意義

　　由此可見，dc亞型分布情況、nk細胞含量在判斷非小細胞肺癌患者病情發展上有一定的臨床意義，它們同卡氏評分、是否化療等臨床特征之間均有十分密切的關系。所以，當肺癌發生時，宿主的dc亞群及nk細胞的功能低下、比例失調，導致機體免疫平衡失調。

　　隨著腫瘤患者病情的發展，腫瘤某些生物學特征（機體免疫狀態和其他一些生物學指標等）同時發生一些變化，進而提示這些指標之間有一定的相關性。本組研究表明，晚期非小細胞肺癌患者在接受化療過程中，隨著卡氏評分的逐漸降低，機體免疫功能逐漸下降，與此同時，dc各亞型的百分比也明顯下降；提示肺癌患者外周血dc亞型與機體免疫狀態之間有一種間接的相關性。

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