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多通道抗凝血藥物篩選檢測儀的研制電科論文
摘要：
介紹一種以透射比濁法為設計原理，單片機89C52為核心的96通道高速抗凝血藥物篩選平臺。該儀器自動完成血液（血漿）凝血時間的實時檢測及數據采集，數據采集的精度、速度及靈敏度較傳統的凝血時間測量儀器有較大的提高。提出了將凝血時間測量用于相關藥物篩選的新途徑。
關鍵詞：
檢測儀 單片機 凝血時間 藥物篩選
血液凝固的過程非常復雜的。生物體在正常生理狀態下，血液中的凝血系統與抗凝血系統處于自我調節的一種平衡狀態，如果這種平衡被破壞，就會形成凝血系統疾病。現在臨床上最常用的抗凝血類藥物是肝素，這種藥物雖然有很好的抗凝血效果，卻伴隨著血和血小板減少等副作用，而且當患者本身患有彌散性血管內凝血等疾病時便無法采用。現有的口服類抗凝血藥物（如節丙酮香豆素[1]）的使用效果又不甚理想。因此，新型抗凝血藥物的研制工作是非常必要的。
進行抗凝血藥物開發的第一步就是要檢驗藥物的抗凝效果，也就是凝血時間的檢測。現在際上普通認可的測量凝血時間的指標主要有兩個：凝血酶原時間（Prothrombin Time,PT）和活化部分凝血活酶時間（Actived Partial Thromboplastin Time,APTT）。這兩個指標是由國際血液學標準化委員會（ICSH）、估計血檢與止血委員會（ICTH）和美國臨床檢驗標準委員會（NCCLS）聯合制定分布的[2]。PT和APTT不僅能取代傳統的Duke法出血時間和玻片法凝血時間而作為新的臨床止血功能指標，并且能為抗凝血藥物開發過程提供更好的監控指標。
正常的凝血過程時間很短，即使加入抗凝劑，也不會超過1分鐘。正常情況下，PT不會超過20秒，這給手工測量帶來了很大的困難。為了尋求方便的檢測途徑，國內外許多企業已經開始研制相關的自動化凝血時間測量儀，并且已經投放市場如德國TECO公司的TEChrom IV plus 4通道半自動血栓/止血測定儀；法國BIOCHEM公司STAGO全自動血栓/止血分析儀等。這些凝血測量儀雖然可以完成一個或幾個樣品的同時檢測，但是仍然沿用臨床檢測的套路，檢測速度有限，樣品用量比較大，樣品波大都固定于儀器上，清洗不方便，同時價格也相當昂貴，不適用于藥物開發。
為了提高凝血測量儀的性能，同時滿足高通量的藥物篩選的需求，我們利用單片機設計了一套新型的凝血時間自動檢測儀，目的在于為新藥開發質量控制提供便利。這臺小型的凝血時間測量裝置（體積僅30cm×20cm×12cm）不僅能夠進行96路并行實時檢測，而且樣品用量少（20μl），靈敏度高（0.1秒），具有很好的應用前景。
1 測量原理
血液的凝固從物理上來講就是非溶性纖維蛋白形成的過程，而且在很短的時間內非溶性纖維蛋白的數量會陡然增加。這樣，整個血液的透光率就會迅速降低（濁度升高），一段時間后就會漸漸變緩。通常我們所測量的凝血時間也就是指非溶性纖維蛋白形成的起始階段，即濁度變化達到三倍信澡比的時間。
透射比濁法正是利用了血液在凝血過程中濁度突然升高的原理來設計的。只要檢測器件具有足夠的靈敏度，就可以檢測出血液凝固的時間。
2 檢測儀設計
2.1 樣品池設計
檢測儀采用標準平底透明96孔板作為樣品池，其上、下方分別為一一對應光敏二極管和發光二極管，樣品池采用抽屜式結構。每次使用可以將抽屜拉出，放上96孔板，再加入凝血試劑和血液（血漿），然后啟動檢測開關，開始數據采集。
2.2 電路設計
由于通過光敏二極管接收到的電壓信號變化量往往比較低（幾個mV），對于光源手檢測器件的選擇至關重要的。因此，在儀器設計以前，首先選用了幾個不同的發光二極管（以下簡稱LED）和與其對應的光敏二極管對凝血過程透光率進行了實測相應的理論計算。
圖1所示為光敏二極管的基本電路。二極管兩端的電流為：
式中，I為通過不敏二極管的電流，Is為反向飽和電流，VD為二極管兩端電壓，VT=kT/q稱為混度進行當量，其中k為玻爾茲曼常數，T為熱力學溫度，q為電子的電量。在300K時，VT≈26mV。反向偏置時，只要|VD|大于VT幾倍以上，I=-Is，其中負號表示反向電流。
實驗證明，光敏二極管的反向電流在一定范圍內與LED上的加載電壓存在正比的函數關系，如圖2所示。這是因為LED正常發光過程中，LED加載電壓與輸出光強存在正比關系；光敏二極管的反向電流與其吸收光強也存在正比的函數關系。根據這一點我們可以做如下推斷：
假設通過光敏二極管的吸收光強為φ，則
I=-Is=Cφ+m≈Cφ
其中，C與m為僅隨溫度而變化的因子，m≈0。
與光敏二極管串聯的電阻R兩端電壓V=IR=CφR，并有：φ=φ0+Δφ，V=V0+ΔV,V0=CRφ0, ΔV=CRΔφ。其中，V0和φ0為凝血反應開始之前R電阻兩端的電壓與光敏二極管的吸收光強。
在凝血反應開始之后的某一時刻，吸收光強為φ=φ0(1-ε)，ε為某一時刻光強變化的百分比，則Δφ=φ-φΔ0=-εφ0,所以
ΔV=-εCφ0R=-εV0 ΔV/V0=-ε
可以看到，電阻R兩端的電壓變化僅與ε和V0有關。ε對于固定時刻和固定的反應體系來說是不變的，因此，ΔV僅與V0有關。也就是說，在某一確定的時刻，信號電壓變化的百分比只與反應體系有關。根據這個結論，我們只要通過選擇合適的元器件并加以調節，提高初始輸入電壓V0，就可保證ΔV足夠大。
在設計過程中，我們選擇光強高、波長適宜、直徑為5mm的藍色高亮發光二極管陣列作為光源，并連接可調節電源來同時控制所有發光二極管的亮度；選擇相應的直徑為5mm的光敏二極管陣列作為檢測元件，串連50k電位器用于逐個調節每個二極管的初始輸出電壓，消除每對發光二極管和光敏二極管之間存在的個體差異；最后選擇高精度A/D轉換器來采集數據。實驗測量顯示，當溶液總體積不低于60μl時，采用16位的A/D轉換器便可滿足測量精度的要求。
圖3與基本結構的原理圖。整個儀器以Atmel公司的AT89C52（以下稱間C52）單片機為核心實現數據采集和控制，配合電-光-電轉換電路的A/D轉換器（ADC）等來檢測樣品的透光率及其變化。A/D轉換器采用Analog Devices公司的16位ADC——AD7660，儀器分辨率達到2 16，大致相當于一個4位半萬用表的精度；ADC的量程是0～2.5V。
單片機設置完成D/A轉換器（MAX7224KCWN，8-bitDAC，Maxim Integrated Products）后，光敏二極管串聯電位器上的電壓數據通過多路模擬開關（MAX306CWI，16-Channel,Maxim Integrated Products）選擇后送到ADC進行模數轉換，轉換后的數據被C52讀取。C52發出的數據再經MAXRS232（MAXRS232CWE，Maxim Integrated Products）進行電平轉換，通過串口傳入計算機。
2.4 軟件設計
編程采用微軟公司的Microsoft Visual Basic 6.0，功能實現包括以下四個主要部分：
（1）串口測試 使用前對連接串口進行測試，工作正常則數據碼管顯示閃爍0。
（2）初始電壓檢查 檢查所有發光二極管和光敏二
極管是否正常工作。為了讓所有并行孔的初始電壓盡可能接近，可以調節每個光敏二極管的對應串聯電位器，這時數碼管顯示相應電壓值（V）。
（3）設計檢測通道 可以任意選擇幾個通道進行檢測，同時確定檢測時間。儀器還帶有檢測電源及外接通道的功能，正常運轉情況下不用調節。
（4）實驗 為了方便實驗人員，實驗的開始時間采用點動開關控制。數碼管顯示時間。實驗過程中可實時顯示任意四個通道的數據變化。實驗正常完成，數碼管顯示0b。數據存在csv類型文件，該文件可以用excel打開。但由于excel最多只能顯示256列，因此最多只能顯示85個通道數據。這個問題可以通過excel導入csv文件數據解決，結果分成兩個文件顯示。
3 儀器參數及測量方法
開啟光源之后需要預熱20分種，待光源和溫度穩定以后再開始實驗。實驗的溫度控制由處于抽屜底部的熱敏傳感器來完成。由于整個檢測儀有較高的電流通過，在開啟預熱過程中溫度很容易超過37℃，因此我們沒有采用常用的加熱式和水浴式控溫電路，而是采用多個風扇來控制較小空間內的溫度升高。
抗凝血藥物篩選檢測儀的采集速率為1000個數據/秒，因此如果96路同時檢測，時間精度為0.1秒。因此當測量通道少于96路，時間精度會進一步提高。實驗檢測樣本體積必須大于或等于20μl，總體積大于等于60μl。
在不加任何試劑的情況下開啟儀器采集數據，理論上每個通道采集到的電壓數據應該保持不變，實際上可以得到由于各種干擾引起的系統誤差，多次重復得到系統誤差為2mV。根據臨床上的通常算法，以偏離基準電壓三倍系統誤差的時間作為反應起始時間，即凝血時間。溶液濁度增高，在光敏二極管上反映為電壓的下降。當測量數據的電壓值低于基準值6mV的時刻作為凝血時間，這種確定方法適用于PT和APTT。
以60μl凝血測量體系（20μl樣本+40μl凝血試劑）對儀器進行檢測。隨機選擇六個通道進行平行PT檢測，結果重復性良好，如表1所示。這里使用的PT試劑為Sigma公司的診斷試劑ThromboMAX with Calcium，其中1、2、3號樣本為正常新鮮血漿；4、5、6號為加入肝素作為抗凝劑的血漿。由于僅測量六路信號；PT檢測精確度提高至0.01秒。經過多次實驗檢測，同一樣品在各個通道中檢測的標準偏差為0.06，同一樣品在同一個孔中重復10位的標準偏差為0.04。
表1 六路PT平行檢測結果
編號123456PT/s12.4012.4512.4916.3016.4016.32
據報道，PT的正常測定值為12.4秒[2]，根據不同個體情況會有所偏差。可以看出，表1中的PT檢測結果是可靠的。通過PT時間還可算出PT比、PT活性百分比和國際標準化值INR（International Calibrated Ratio）。
設計的抗凝血藥物篩選檢測儀攜帶方便、成本較低、操作簡單、檢測速度及靈敏度高，不僅可以用于抗凝血藥物的大批量初篩，同時也可用于臨床大量血樣的凝血參數測定。這是我們所知到目前為止將凝血時間測量用于相關藥物篩選的首次報道。
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