淀粉酶活性測定方法的改進-李雯

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淀粉酶活性測定方法的改進-李雯

植物生理學通訊　　第４１卷　第５期，２００５年１０月655

淀粉酶活性測定方法的改進

李雯１，２　　邵遠志１　　陳維信２，＊

１

海南大學生命科學與農學院，海口５７０２２８；２華南農業大學園藝學院第一文庫網，廣州５１０６４２

Improved Method for Determining Amylase Activity

LI Wen1,2, SHAO Yuan-Zhi1, CHEN Wei-Xin2,*

College of Life Science and Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China; 2College of Horticulture, South ChinaAgricultural University, Guangzhou 510642, China

提要　　以香蕉果實為試材，對常規的淀粉酶活性的測定方法進行了改進，取得了更好的效果。關鍵詞　　淀粉酶活性；測定方法；

改進

淀粉酶是反映淀粉分解速度、研究糖代謝規律的一個重要指標之一。香蕉是典型的貯藏淀粉的果實，果實采后其淀粉轉化為可溶性糖。了解淀粉酶活性的變化規律對研究香蕉果實采后生理及貯藏保鮮十分重要。測定淀粉酶活性常采用的是酶動力學方法中的化學法［１］。果實淀粉酶活性的測定一般是借鑒文獻２￣４的方法，但這些方法在測定香蕉果實淀粉酶活性時，操作繁瑣，重復性較差。本文就酶液的提取、反應步驟的取舍等方面對這些方法作了改進，取得了較好的效果。

劑為國產分析純試劑。２．２　　測定方法

２．２．１　　酶液的提取　　將每一個重復的３個果實去皮后切碎混勻，稱取其果肉１　ｇ，置于預冷的研缽中，加２　ｍＬ預冷的０．１　ｍｏｌ·Ｌ－１檸檬酸溶液（ｐＨ５．６）和少量石英砂研磨，將勻漿移入７　ｍＬ的離心管中，再分別用１　ｍＬ的０．１　ｍｏｌ·Ｌ－１檸檬酸緩沖液（ｐＨ　５．６）沖洗２次，　于４℃下以１５　０００×ｇ離心１５ｍｉｎ，上清液轉移入另一個５　ｍＬ離心管中，作為酶提取液備用。

２．２．２　　酶活性的測定　　取潔凈的試管１８支，作好標記，每一個樣品設１個對照。總反應體積為０．５ｍＬ，測定管含０．２　ｍＬ的酶提取液和０．３　ｍＬ的１％淀粉溶液；對照管含０．２　ｍＬ的酶提取液和０．３　ｍＬ的０．１　ｍｏｌ·Ｌ－１　檸檬酸溶液（ｐＨ　５．６，　不含底物淀粉）。將試管放入恒溫４０℃的水浴鍋中，保溫３０　ｍｉｎ后取出，立即加入１．５　ｍＬ的ＤＮＳ試劑終止反應。再將試管置于沸水浴中１０　ｍｉｎ，取出后冰浴冷卻。取反應液稀釋１０倍，測定波長５２０　ｎｍ處的吸光值，同上做麥芽糖標準曲線，從標準曲線上查出麥芽糖的含量，計算淀粉酶的總活性。

上述的酶的提取和測定，與文獻２的常規方法相比較，有以下４個改進：（１）可用緩沖液作為淀粉酶的提取液和底物淀粉的溶液；（２）將原來的

材料與方法

１　　材料

實驗在華南農業大學的廣東省果蔬保鮮重點實驗室進行。材料為巴西香蕉果實（Ｍｕｓａ　ｓｐｐ．　ＡＡＡＧｒｏｕｐ，　Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ），購自水果市場。試材選３種成熟度差異非常明顯的果實進行測定：（１）綠熟硬果，（２）中等黃熟微軟果，（３）黃熟極軟果。所選果實大小一致、無病蟲害、無機械傷，每類果實９個果，重復３次。２　　方法

２．１　　試劑配制　　淀粉酶提取緩沖液：０．１　ｍｏｌ·Ｌ－１檸檬酸溶液（ｐＨ　５．６）；　１％的淀粉溶液：用０．１　ｍｏｌ·Ｌ－１的檸檬酸緩沖液（ｐＨ　５．６）配制；標準麥芽糖溶液（１　ｍｇ·ｍＬ－１）；　３，５－二硝基水楊酸試劑（ＤＮＳ試劑）：　稱取６．５　ｇ　３，５－二硝基水楊酸溶于少量水中，移入１　０００　ｍＬ容量瓶中，加入３２５　ｍＬ　２　ｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＯＨ溶液，再加入４５　ｇ丙三醇，搖勻，冷卻后定容到１　０００　ｍＬ。淀粉和麥芽糖為Ｓｉｇｍａ產品，其余試

656植物生理學通訊　　第４１卷　第５期，２００５年１０月

３次稀釋步驟改為只稀釋１次；（３）不用ＮａＯＨ溶液

終止反應，而用ＤＮＳ試劑顯色同時終止反應；（４）耗時從５　ｈ　減少到３．５　ｈ。

結果是一致的，說明改進方法可以反映香蕉果實后熟過程中淀粉酶活性的變化情況，具有可操作性；（２）常規方法測得的淀粉酶活性比改進方法測得的低，２種方法測得的３種成熟度果實的酶活性分別相差０．３３８、０．３５１和０．２５１　ｍｇ·ｇ－１（ＦＷ）·ｈ－１，表明改進的方法可測得更高的淀粉酶活性；（３）３種成熟度果實中淀粉酶活性的標準誤值和變異系數都小于常規方法，說明改進的方法其實驗誤差比常規方法小。

結果與討論

從表１可以看出：（１）綠熟硬果、中等黃熟微軟果、黃熟極軟果３種不同成熟度的果實淀粉酶活性表現出低、高、低的趨勢，各成熟度果實間存在極顯著差異（Ｐ＜０．０１），２種測定方法得到的

表１　　香蕉果實中淀粉酶活性測定方法的比較

酶活性／ｍｇ·ｇ－１（ＦＷ）·ｈ－１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　標準誤　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　變異系數／％

果實類別　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　常規方法　　　　　　　　　　　　　　　　改進方法　　　　　　　　　　　　　常規方法　　　　　　　　　　　　　　改進方法　　　　　　　　　　　　常規方法　　　　　　　　　　　　　　改進方法

綠熟硬果中等黃熟微軟果黃熟極軟果

１．５３４Ｂ２．１４７Ａ０．５５５Ｃ

１．８７２Ｂ２．４９８Ａ０．８０６Ｃ

０．３０３０．３３００．２８７

０．１２６０．１９６０．１１５

１９．７６０１５．４１２５１．７１２

６．７４８　　７．８３４１４．２４２

常規方法（對比測定）使用文獻２的方法。

酶活性的測定受多種因素的影響［５］。通過以上實驗，我們認為還須特別注意以下幾點：（１）取樣前，要把水浴鍋的水溫調整到需要的溫度，為后續的反應過程做好準備；（２）研磨樣品和轉移樣品時，速度要快，準確，以避免樣品損失帶來的誤差；（３）酶反應時，先往反應管中加底物溶液，后加酶提取液，而且一次不要做太多的樣品，以避免加樣先與后的時間差異對實驗結果的影響；（４）測定吸光值時，先要檢查比色杯是否有差異，哪怕是微小的差異也要避免，以防止結果呈現負值的現象發生（由于比色杯本身的差異可造

成對照管的吸光值大于樣品管的吸光值）。

參考文獻

１２３４

陳石根，周潤琪編著．酶學．上海：復旦大學出版社，２００１．　２２１￣２２８

韓亞珊主編．　食品化學實驗指導．　北京：中國農業出版社，１９９６．　１０６￣１０９

李合生主編．植物生理生化實驗原理和技術．　北京：高等教育出版社，２０００．　１６９￣１７２

周蓓云．　α－和β－淀粉酶活性的測定．　見：中國科學院上海植物生理研究所，上海市植物生理學會編．　現代植物生理學實驗指南．　北京：科學出版社，１９９９．　１２３￣１２４

彭志英編著．　食品酶學導論．　上海：中國輕工業出版社，２００２．　１１￣１５

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