蛋白提取方法

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織和細胞的來源：

1.1.2 儀器設備

機械組織勻漿器

低溫高速離心機 (>40,000 g)

超速離心機

超生細胞破碎儀

超純水裝置

1.1.3 試劑

三氯醋酸 (TCA)

丙酮

二硫蘇糖醇 (DTT)

尿素

CHAPS

PMSF

EDTA

乙醇

磷酸

考馬斯亮藍R350

抑肽素A

亮肽素

試劑純度均應是分析純或以上。

1.1.4 溶液配制

(1) PBS：

NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl調pH至7.4，用純水定容至1 L；

(2) EDTA 儲存液：

18.61 g Na2EDTA?2H2O，溶于70 ml純水中，用10 mol/L NaOH調節pH值至8.0 (約需2 g NaOH顆粒)，定容為100 ml。可高壓滅菌后分裝備用；

(3) 亮肽素儲存液 (50 μg/ml，100×)

10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用時配成50 μg/ml儲液，-20℃保存；

(4) 抑肽素儲存液 (70 μg/ml，100×)

1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用時配成70 μg/ml儲液，-20℃保存；

(5) PMSF儲存液 (10 mM, 100×):

17.4 mg PMSF，溶于1ml異丙醇中，-20℃ 保存。

DTT 儲存液 (1 M):

0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理，可過濾除菌)。

(7) 裂解液:

Lysis buffer A

(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer B

(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer C

40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O

Lysis buffer D

(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)

Lysis buffer E

(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer F

100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)

●CA、蛋白酶抑制劑混合物和DTT在臨用前加入。

蛋白酶抑制劑混合物[3]

成分 終濃度

蛋白酶抑制劑混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mM

EDTA 0.3 mg/ml (1 mM)

抑肽素 0.7 μg/ml

亮肽素 0.5 μg/ml

1.2 方法

1.1.1組織蛋白提取方法

1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1]

(1)冰上取材，稱濕重，置液氮中凍存或直接進行下一步；

(2)在液氮中研碎樣品或使用機械勻漿器磨碎組織；

(3)將粉末懸浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中；

(4)蛋白–20℃沉淀過夜；

(5)35000×g(6℃)離心30min；

將沉淀重懸于含0.2%DTT的預冷丙酮中；

(7)-20℃放置1h；

35000×g(6℃)離心30min；

(9)在通風櫥中讓丙酮充分揮發，得到干燥的沉淀；

(10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg組織需要1ml裂解液）；

(11)15℃,40000×g，離心1hr；

(12)用Bradford法[2]測定上清的蛋白濃度，分裝后置–75℃保存。

1.2.1.2超速離心法

(1)取材；

(2)用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末，每1g樣品加入0.5ml裂解液，使用組織勻漿器勻漿30s；

(3)組織懸液15℃，10000×g離心10min；

(4)上清液4℃，150000×g超速離心45min；

(5)小心避開上層漂浮的脂質層，吸取離心上清6℃40,000g再次離心50min；

取離心上清。Bradford法定量，分裝后置–75℃保存。

1.2.2培養細胞蛋白提取

1.2.2.1循環凍融法

(1)吸出培養液棄去，0.01mol/LPBS洗一次；

(2)加入PBS，用橡膠刮收集細胞于10ml離心管中；

(3)500×g，離心5min；

(4)棄上清，PBS洗三次（室溫,500×g，5min），

(5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中；

執行Biofuge存儲程序8，500×g5min離心；

(7)用200μl微量加液器吸出PBS，棄去；

吸干殘留的PBS，估計樣品體積，加入5倍體積裂解液，巴氏滴管混勻，液氮中反復凍融三次(每次置液氮中3s，室溫融化)，DTT在第一次凍融后加入；

(9)執行Biofuge存儲程序6，15℃，40000×g，離心1hr(Biofuge)；

(10)上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存備用。

1.2.2.2超聲破碎法

(1)取對數生長期的細胞，吸出培養液棄去，0.01mol/LPBS洗一次；

(2)加入PBS，用橡膠刮收集細胞于10ml離心管中；

(3)室溫，500×g，離心5min；

(4)棄上清，PBS洗3次（室溫,500×g，5min）；

(5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500×g離心5min；

吸干殘留的PBS，估計樣品體積，加入5倍體積裂解液，混勻，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超聲破碎細胞（3×10s）；

(7)15℃,40000×g，離心1hr(Biofuge)；

上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存備用。

2結果和討論

蛋白質提取的基本步驟包括清洗組織或細胞、裂解細胞、離心除去膜組分等獲得溶解的蛋白質上清。

我們破碎細胞采用循環凍融法和超聲波法；破碎組織采用液氮研磨法和機械勻漿法。循環凍融法操作簡便，比較適合提取培養細胞的穩定蛋白，我們后期實驗對培養細胞主要采取這種破碎方式。使用超聲破碎必須注意的是控制強度在一定限度，即剛好低于溶液產生泡沫的水平。因為產生泡沫會導致蛋白質變性，同時要注意散熱。勻漿是機體軟組織破碎最常用的`方法之一。由于勻漿過程中蛋白質被蛋白酶降解的可能性較小，所以勻漿是簡便、迅速和風險小的組織破碎方法，我們實驗室在破碎腦和脊髓組織時常用此法；由于神經組織比較柔軟，液氮研磨法也很適合，本實驗中我們使用了這一方法破碎大鼠脊髓組織，中樞神經組織由于富含脂類，沉淀法和高速離心法可以使蛋白和脂類干擾物質有效分離，但沉淀法的缺點是再溶解時蛋白損失嚴重。高速離心的缺點是需要樣品量大，如BeckmanL7-65超速離心機的離心管容量為8ml，不適用小量樣品的制備。

在眾多的裂解液配方中，我們主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%兩性電解質加蛋白酶抑制劑混合物，原因是這一配方經長期使用很穩定，裂解效率也較高，非常適合小量細胞蛋白提取要求。針對富脂的中樞神經組織中脂類物質與蛋白相互作用，高濃度的尿素可以造成強變性條件(但如果再提高尿素濃度，尿素就容易析出，影響蛋白的溶解)，過量的去污劑也可以減少脂類的污染，兩性電解質可以提高蛋白的溶解度，同時

有利于等待聚焦。早期我們加入Tris堿以防止蛋白的水解，但是由于鹽離子的引入，導致IEF電壓過低，影響聚焦。

【蛋白提取方法】相關文章：

組織蛋白提取方法07-18

活性蛋白提取方法07-18

核蛋白提取方法07-18

胞漿蛋白提取方法07-18

液體樣本蛋白提取方法07-18

植物總蛋白提取方法07-18

植物核蛋白提取方法07-18

不同組織的蛋白提取方法07-18

脂肪組織蛋白的提取方法07-18