一種用于穿透多肽篩選的隨機文庫的構建及篩選

以增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)為示蹤物,在pET-14b載體上構建編碼12個氨基酸的隨機多肽表達文庫.建立一種簡便、經濟、有效的文庫篩選方法,從所構建的文庫中篩選出細胞穿透多肽(cell-penetrating peptide,CPP).采用點突變技術,首先在pET-14b載體多克隆位點Nde Ⅰ和Xho Ⅰ之間加入4個限制性內切酶位點,隨后在BamHⅠ位點后加入三聯終止密碼子,接著再利用亞克隆的方法在Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ之間插入EGFP,形成一個新的用于原核表達示蹤蛋白的載體pET-14bMCStop/EGFP.最后再利用點突變技術在上述構建的示蹤載體的多克隆位點XhoⅠ和BamH Ⅰ之間插入36個隨機堿基序列.以His-Tat-EGFP作為工具建立有效的篩選方法,利用這種方法對文庫進行篩選.酶切和測序表明,示蹤載體的構建是正確的,且在大腸桿菌中可有效地表達出His標記的EGFP.在示蹤載體的基礎上構建的隨機多肽文庫至少包含了105個獨立克隆,其中90%以上的克隆插入的隨機片段都是36個堿基.建立的篩選方法是可行的,并用此方法進行了初步的篩選.

作 者： 劉瑜 劉亞偉 李海玉 劉靖華 鄧鵬 姜勇 LIU Yu LIU Ya-Wei LI Hai-Yu LIU Jing-Hua DENG Peng JIANG Yong   作者單位： 南方醫科大學廣東省功能蛋白質組學重點實驗室和病理生理學教研室,廣州,510515  刊 名： 中國生物化學與分子生物學報  ISTIC PKU 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY  年，卷(期)： 2006 22(6)  分類號： Q2  關鍵詞： 細胞穿透多肽   隨機多肽文庫   跨膜轉運   內化  

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