斑替枝孢生物學特性及致病性初步的研究論文

　　加州鱸魚(Micropterus salmonides)原名大口黑鱸,分類學上屬鱸形目(Perciformes),太陽魚科[1],身體長而側扁,稍紡錘形,橫截面為橢圓形。全身覆蓋銀白色或淡黃色細密鱗片,但脊柱顏色較深,通常呈綠青色或淡黑色,同時沿側線附近常有黑色斑紋。腹部呈灰白色。背肉稍厚,墨綠色,體側青綠。生活在淡水湖泊,原產自美洲,1983年引進中國進行養殖,通過人工馴化后,性格較溫和,不喜歡跳躍,容易受到驚嚇。加州鱸魚通常可以在1%以下的咸淡水域中正常生長,水質要求每升水溶氧量在1.5 mg以上,比鱸魚、鱖魚耐低氧能力強[2]。鱸魚肉是高蛋白食物,維生素A和維生素B豐富,滋補肝腎,健脾和胃,而且對感冒止咳有很好的功效,能化痰止咳,含有豐富的微量元素鈣、鎂、鋅、硒等。加州鱸魚生長迅速,肉質鮮美,容易養殖,且經濟效益高,是中國常見的淡水養殖品種。草魚(Ctenopharyngodon idellus)屬鯉形目鯉科,是中國重要的淡水養殖魚類,它和鰱、鳙、青魚一起,構成了中國著名的“四大家魚”[3]。

　　本研究所用菌株是從患病加州鱸魚體表分離,通過分子鑒定和形態鑒定,初步鑒定為斑替枝孢(Cladosporium bantianum),屬真菌門(Fung)半知菌亞門(Deuter omycota)絲孢綱(Hyphomycetes)叢梗孢目(Miniliales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢屬(Cladosporium)。能引起皮膚暗色絲孢霉病[4],尤其侵染腦部引起腦囊腫或膿腫,少數為腦膜炎[5]。在PDA和PCA培養基上生長迅速,菌落扁平。鼠灰色絨毛狀,中央高凸,呈紐扣狀,表面有不規則皺褶,37 ℃生長良好。在Sabourand培養基上,菌落稍大,灰棕色絨毛狀,背面黑色。菌絲灰棕色,分生孢子橢圓形、梨形、鏈生[6]。

　　為研究斑替枝孢的生物學特性和對其他淡水魚類的致病性,本試驗通過不同pH和不同溫度條件對該真菌的生長狀況和菌落大小的影響,研究該真菌的生物學特性。同時將該真菌回復感染草魚和鯉魚,觀察真菌對草魚和鯉魚是否具有致病性,為淡水魚類的中草藥防治提供一定的理論依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　該菌株分離自患病加州鱸魚體表潰爛處,在PDA培養基上純培養,將獲得的純培養菌株保存于5 ℃冰箱備用。菌株的分離與鑒定見魏福倫等[6]的報道。

　　1.2 方法

　　1.2.1 不同pH對斑替枝孢的影響 將該真菌接種在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的PDA培養基上,在25 ℃下恒溫培養,觀察真菌菌株的生長狀況,每隔24 h觀察一次,采用十字交叉法測定真菌菌落直徑并記錄下來。每個梯度做3個平板,試驗周期為15 d。

　　1.2.2 不同溫度對斑替枝孢的影響 將該真菌接種在PDA培養基上,在溫度為5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下培養,觀察真菌菌株的生長狀況,測量其直徑記錄下來。每個梯度做3個平板,測量方法同上。試驗周期為14 d。

　　1.2.3 斑替枝孢的致病性 用于回復感染的淡水魚是草魚和鯉魚,取自烏江網箱[7]。取回后置自然條件下培養,待魚在自然環境中生長狀況穩定后進行回復感染。每組10尾魚裝到養魚箱中,每次試驗3箱魚,一箱為對照組,另兩箱為試驗組。對照組將真菌菌株接種在魚胸鰭下,放進魚箱中培養。試驗組一箱魚直接刮入真菌菌株進行培養,另一箱魚在魚胸鰭下接種真菌菌株。每24 h觀察一次,觀察該菌對淡水魚是否具有致病性。記錄每天的觀察結果,試驗周期為20 d。

　　1.2.4 數據分析 用SPSS_Statistics-v19.0win32軟件進行差異性計算,用SPSS軟件的單樣本t檢驗計算t值及Sig.(雙側)值。將Sig.(雙側)值與p值進行比較,p值表示概率,得出差異性是否顯著。

　　2 結果與分析

　　2.1 不同pH對斑替枝孢的影響

　　由表1、圖1可知,斑替枝孢在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的條件下均能生長。由表1可知,t值各不相同,但Sig.(雙側)值均為0.000,小于顯著水平0.05,與t檢驗的零假設相符,即不同pH之間菌落生長速率存在顯著差異(接種菌餅均為2 mm)。pH 9.0時,真菌生長速度最快,菌落直徑達52.3 mm,菌落最為致密,pH 7.0、8.0時,真菌生長速度也相對較快,菌落直徑分別達51.3、52.0 mm,因此最適生長的pH為9.0。

　　2.2 不同溫度對斑替枝孢的影響

　　真菌的生長狀況在不同溫度下有明顯的差異,在溫度低于5 ℃和高于35 ℃時,均不能生長(接種菌直徑為2 mm)。在10~30 ℃范圍內,該菌的生長速度隨溫度的升高而增快,在20 ℃時生長速度相對較快,菌落直徑達61.7 mm,菌落最為致密。25 ℃時,真菌生長速度也相對較快,菌落大小為58.7 mm,但菌落不如20 ℃時致密。因此20 ℃為斑替枝孢的最適生長溫度。用SPSS軟件計算t值和Sig.(雙側)值,t值各不相同,Sig.(雙側)值均小于顯著水平0.05,與t檢驗的零假設不相符,存在顯著性差異(表2、圖2)。

　　2.3 斑替枝孢的致病性

　　將真菌菌株接種于草魚和鯉魚,培養后觀察,發現此菌株對草魚和鯉魚的生長沒有明顯的影響,沒有引起淡水魚患病或死亡。在魚體的傷口周圍取材進行再培養,沒有發現埃里格孢,初步判斷斑替枝孢不感染草魚和鯉魚,單一菌株的斑替枝孢可能對淡水魚無致病性。

　　3 小結與討論

　　斑替枝孢是枝孢屬真菌,屬半知菌亞門,菌絲體淡褐色至褐色,有時產生子座。斑替枝孢又叫毛樣枝孢霉、枝孢樣枝孢霉,為腐生真菌,廣泛存在于自然界的土壤、某些動物的糞便、蔬菜、腐木、鳥巢、腐爛水果中[8],而從魚類體表潰爛傷口分離該菌株則屬首次。

　　為了對斑替枝孢引起的病害進行有效防治,對從患病加州鱸魚體上分離的該菌進行生物學特性的研究。研究結果表明,該菌株在PDA培養基上pH為5.0~11.0時均能生長,以pH 9.0時生長最快,菌落最為致密,直徑達52.3 mm,為該真菌最適生長pH。該真菌在不同溫度下有明顯的差異,在溫度低于5 ℃和高于35 ℃時,均不能生長。在20 ℃時該菌生長較快,菌落直徑達61.7 mm,菌落最為致密,為斑替枝孢的最適生長溫度。表明該菌對于溫度、pH等條件適應范圍廣,要求不嚴格,具有很強的環境適應性。

　　將該真菌單一接種于草魚和鯉魚,并沒有表現出對草魚和鯉魚的致病性,這有可能是水質問題影響了試驗的結果,該菌是否有可能與其他病原菌相互作用、交叉感染而導致淡水魚類患病,還有待下一步驗證。此次試驗結果為下一步研究該菌對淡水魚的致病性提供了一定的參考依據。

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