關于生物學中“Blotting”方法的簡介及總結

簡介：印跡（blotting）是生物學實驗中常用的檢測和分析方法。印跡（blotting）實驗的過程可以簡單描述為將待檢測的生物大分子經電泳等方法分離后轉移并固定在膜（如：硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜）上，然后用特異性識別物質（如探針）去識別，最后經顯色反應（同位素放射自顯影、熒光、化學發光等）在膜上顯示出結果：印跡。

最早出現的blotting技術是Southern Blotting，它是檢測DNA的一種方法。這項技術由英國生物學家EdwinSouthern在20世紀70年代發明，科學界便以發明者的名字來命名這項技術------SouthernBlotting。1977年，美國斯坦福大學的JamesAlwine，DavidKemp，和GeorgeStark在PNAS上發表文章，提出了類似于SouthernBlotting，但卻是用來檢測RNA的技術。由于跟Southern Blotting比較相近，于是便有了NorthernBlotting這個名稱。后來，GeorgeStark又發明了用于檢測蛋白質的blotting技術，W. Neal Burnette玩了一把“文字游戲”將這項技術命名為WesternBlotting，這個名字很快也被廣泛接受并流行起來。

WesternBlotting與Southern Blotting、Northern Blotting的區別

其實，WesternBlotting與Southern Blotting、Northern Blotting的技術原理差別還是比較大的。這種差別體現在Southern Blotting和Northern Blotting是基于DNA和RNA分子之間堿基互補配對的特異性識別能力，而Western Blotting則基于抗原抗體之間特異的免疫反應。Southern Blotting和NorthernBlotting時使用帶有標記（如同位素標記或熒光標記）的DNA或RNA探針去識別并結合到待檢測核酸上，然后直接顯影；而WesternBlotting時要先用待檢測蛋白的“一抗”結合到待檢測蛋白上，再用可識別“一抗”并偶聯了某種酶的“二抗去檢測”一抗“，最后通過顯色反應的信號來顯示待檢測蛋白的存在與否及量的多少。

另外，Southern Blotting和Northern Blotting兩者比較容易混淆。這兩種技術最關鍵的區別在于待檢測核酸的屬性，如果被檢測的.是DNA，則該技術就是Southern Blotting，其探針可以是DNA也可以是RNA；類似地，如果被檢測的是RNA，不管探針是RNA還是DNA，該方法就叫作Northern Blotting。

除了以上三種Blotting技術，還有兩種不太常見的Blotting技術：EasternBlotting和Southwestern blotting。

Eastern Blotting

是一種檢測蛋白質翻譯后修飾的技術，其檢測目標是蛋白質上特定的修飾基團或部位，如脂肪酸鏈、糖基、磷酸化的氨基酸等等。在EasternBlotting實驗中，通常要先用2D電泳將蛋白質分離，然后轉到膜上，再用特異的探針去檢測。蛋白質的翻譯后修飾是蛋白質執行功能過程中普遍存在的調控手段！

Southwesternblotting

是一種檢測DNA和蛋白質互作的方法，因此才有Southwestern之稱。首先用SDS-PAGE的方法將蛋白質分離開來并轉移到膜上，然后在尿素的存在下去除SDS使蛋白盡可能復性，最后用帶標記的特定序列的DNA探針去檢測。

以上簡單介紹的幾種Blotting技術都以檢測某種生物大分子的存在（或量的多少）為目的，所使用的去識別待檢測物質的探針或抗體與待檢測物質之間的結合是已知的、確定的。在這一點上做文章，就可以把blotting技術推廣到驗證蛋白質相互作用這個領域。

Far-westernblotting是一種基于western blotting的分子生物學方法，在western blotting中用抗體來檢測目標蛋白，而在far-westernblotting中用能夠與目標蛋白結合的非抗體蛋白質。因此，westernblotting用來檢測特定的蛋白而far-western blotting則用于檢測蛋白質之間的相互作用。

在傳統的western blotting中，凝膠電泳被用來從樣品中分離蛋白質，然后這些蛋白質在blotting過程中被轉移到膜上。目標蛋白在westernblot中被抗體探針識別。far-western blotting用非抗體蛋白來檢測目標蛋白，通過這種方式，與探針結合的蛋白質就被檢測出來了。探針蛋白經常通過一種表達克隆載體在大腸桿菌中被生產出來。

探針蛋白可以通過一種常規的方法——放射自顯影顯現出來，它可以結合像His或FLAG的特殊的親和標簽或者蛋白質的特殊抗體。因此在凝膠電泳前將細胞提取液在煮沸的去垢劑中失活是檢測不需要自然折疊狀態的蛋白質相互作用重要方法。

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